超越传统mRNA的下一代重磅技术？一文了解IVT环状RNA的特点与优势

环状RNA是共价封闭的单链RNA分子。与线性RNA不同，在环状RNA中，通常存在于RNA分子中的3^′和5^′端序列首尾连接在一起，因此没有5^′-端帽子和3^′-端polyA尾巴。

在自然界中，环状RNA的形成依赖于真核细胞的RNA剪接机制，而对于实验室而言，体外转录法（In vitro transcription，IVT）是制备环状RNA更为可行的办法。在这种IVT环状RNA中，通常在GOI上游引入一个IRES元件招募核糖体以启动翻译。

环状RNA的结构特性为其作为疫苗应用提供了良好的实践基础。对于疫苗生产，最常用的疫苗是基于病原体、核酸或者蛋白质/肽分子制作的，它们有各自的特点和局限性。而环状RNA疫苗被认为优于传统mRNA疫苗的原因可被总结为以下几点：

首先，环状RNA更优异的结构使其在生产和运输上更有优势。环状RNA由于其环化结构可保护其免受核酸酶降解，相比线性mRNA分子的生产环境更为宽容——IVT mRNA的生产过程每一步都需要严苛的无核酸酶环境。在运输上和分发过程中，mRNA疫苗总是需要一个低温冷链，但是对于LNP封装的环状RNA疫苗，其热稳定性高于LNP-mRNA。有研究表明，LNP-circRNA在4℃下至少可保存4周，在室温下可保存约30天。

第二，环状RNA的表达持续时间更长，比线性mRNA产生数量更可观的抗原蛋白。研究表明，环状RNA在哺乳动物细胞内的中间半衰期时长是其线性mRNA对照物的2.5倍。并且环状RNA即使在数量适中的情况下，也表达了对树突状细胞呈递具有高度免疫原性的特定抗原。这一特征进一步提升了环状RNA作为高效疫苗的潜力。

第三，经过核苷修饰的mRNA疫苗可引发较强的免疫反应，但也带来了明显的细胞毒性。环状RNA是无修饰的，在具备相当程度的免疫原性的同时时具有较少的相关副作用。

云舟生物的IVT circRNA平台

云舟生物基于Ⅰ型内含子的PIE（Permuted Intron-Exon）系统，开发了可用于制备高产量、高纯度的IVT环状RNA（circRNA）生产平台。

该技术是制备体外环状RNA的最常用的方法，需要一个游离的鸟苷（G-OH）攻击待环化RNA前体的5^′端内含子和相邻外显子的交界处，随后该外显子的末端被置换为3^′-OH。3^′-OH再次插入3^′端内含子和相邻外显子的交界处，取代3^′端内含子的3^′末端，此时导致环状RNA的形成。

通过这种机制生成的IVT环状RNA，具有极少的杂质且进一步减少了疤痕序列。

▲云舟生物表达EGFP的IVT环状RNA转染HEK293T细胞，对比mRNA具有更持久的表达效果

综上所述，IVT环状RNA在RNA疫苗研发领域展现出了显著的应用前景。其高稳定性以及抗原蛋白的长效表达等特性为RNA疫苗的开发提供了强有力的支持。目前，针对COVID-19和黑色素瘤的IVT环状RNA疫苗已进入临床前测试阶段。未来，环状RNA疫苗递送和治疗应用的研发将拥有巨大的发展空间和潜力。

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参考文献

[1] Xie J, Ye F, Deng X, Tang Y, Liang JY, Huang X, Sun Y, Tang H, Lei J, Zheng S, Zou Y. Circular RNA: A promising new star of vaccine. J Transl Int Med. 2023 Dec 20;11(4):372-381.

[2] Perenkov AD, Sergeeva AD, Vedunova MV, Krysko DV. In Vitro Transcribed RNA-Based Platform Vaccines: Past, Present, and Future. Vaccines (Basel). 2023;11(10):1600.

[3] Xie J, Ye F, Deng X, Tang Y, Liang JY, Huang X, Sun Y, Tang H, Lei J, Zheng S, Zou Y. Circular RNA: A promising new star of vaccine. J Transl Int Med. 2023 Dec 20;11(4):372-381.